INTRODUCCION: El benznidazol es un medicamento utilizado en el tratamiento de la enfermedad de Chagas con actividad variable en diferentes cepas de Trypanosoma cruzi relacionándose ésta con el fracaso al tratamiento. El objetivo del presente trabajo fue generar en el laboratorio cepas resistentes al benzidazol y determinar algunas de sus características biológicas y de susceptibilidad a fármacos. METODOLOGÍA: Epimastigotes de T. cruzi (cepa Silvio X10) fueron sometidos a presión continua con dosis crecientes de benznidazol. Se determinaron la cinética de crecimiento, metaciclogenesis, infectividad en células Vero, estabilidad de la resistencia y susceptibilidad cruzada a fármacos, tanto en la cepa nativa (CNativa) como en la resistente (CRes). RESULTADOS: Se observaron diferencias en la cinética de crecimiento, transformación de epimatigotes-tripomastigotes e infectividad en células Vero, siendo esta menor en las CRes. La susceptibilidad al benznidazol en epimastigotes y amastigotes intracelulares fue de CI₅₀ 10,38±1,16 y 10,93±2,20µg/mL en la CNativa y CI₅ 98,86±3,55 y 139,6±2,6µg/mL en la CRes. La CRes no presentó reacción cruzada con ketaconazol, alopurinol y miltefosina en epimastigotes ni con ketaconazol y miltefosina en amastigotes intracelulares. La actividad del nifurtimox y alupurinol en amastigotes intracelulares de la CRes no fue concluyente. La resistencia de la CRes se evidenció tres meses después de retirar el medicamento. CONCLUSIONES: La posibilidad de generar cepas resistentes al benznidazol estables por presión selectiva existe; generando clonos, por sus características de crecimiento, con menos oportunidad de aislarse en el laboratorio. La reacción cruzada de la CRes al nifurtimox en las formas intracelulares deberá precisarse.